Com autorização do seu bispo, em 1927, foi para Madri com o objetivo de se formar em Direito. Um ano depois, durante um retiro espiritual, pediu a Deus para lhe mostrar com clareza o que precisava ser feito e assim, funda o Opus Dei, um caminho moderno de evangelização para a Igreja. Desde então trabalhava na fundação, ao mesmo tempo em que continuava exercendo o seu ministério, especialmente entre os pobres e doentes. Além disso, estudava na Universidade de Madrid e dava aulas para manter a família.

A missão do Opus Dei é a de promover entre os fiéis cristãos de qualquer condição social, uma vida plenamente coerente com a fé no meio do mundo e contribuir deste modo para a evangelização de todos os ambientes da sociedade. Ou seja, difundir a mensagem de que todos os batizados estão chamados a procurar a santidade e a dar a conhecer o Evangelho, tal como o recordou o Concílio Vaticano II. Quando rebenta a guerra civil espanhola e com ela a perseguição religiosa, ele exercitou o ministério na clandestinidade, até conseguir sair de Madri e fixar residência em Burgos. Acabada a guerra, em 1939, regressou à Madri e obteve o doutorado em Direito. Nos anos que se seguiram dirigiu numerosos retiros para leigos, sacerdotes e religiosos.

Em 1946 fixa residência em Roma. Faz o doutorado em Teologia pela Universidade Lateranense. É nomeado consultor de duas Congregações da Cúria Romana, membro honorário da Academia Pontifícia de Teologia e prelado honorário de Sua Santidade. De Roma desloca-se, em numerosas ocasiões, a diversos países da Europa, América Central e do Sul, a fim de impulsionar o estabelecimento e consolidação do Opus Dei nessas regiões.

Josemaría morreu em conseqüência de uma parada cardíaca, no dia 26 de junho de 1975, em seu quarto de trabalho e aos pés de um quadro de Nossa Senhora, a quem lançou o seu último olhar. Todavia, o Opus Dei já estava presente nos cinco continentes, contando com mais de sessenta mil membros de oitenta nacionalidades.

Santificado em 2001, no ano seguinte foi canonizado pelo Papa João Paulo II. A festa litúrgica de São Josemaría Escrivá de Labaguer é celebrada no dia 26 de junho. O seu corpo repousa na Igreja Prelatícia de Santa Maria da Paz, em Roma.